新葡萄88833官网AMG

　　类BBE酶（Berberine bridge enzyme-like enzyme, BBE-like enzyme）属于黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）连接的氧化酶超家族，广泛参与天然产物生物合成中的氧化环化或氧化脱氢过程从而产生结构丰富多样的天然产物，包括大麻素类等具有重要生物活性的天然产物。然而，该家族蛋白催化氧化环化或氧化脱氢反应的选择性机制目前尚不明确。

　　2025年8月19日，新葡萄88833官网AMG，北大-清华生命科学联合中心雷晓光团队与美国加州大学洛杉矶分校的K. N. Houk 团队在《PNAS》上在线发表研究论文，题为："Aspartic acid residues in BBE-like enzymes from Morus alba promote a function shift from oxidative cyclization to dehydrogenation"。该工作对白桑（Morus alba）中类BBE酶催化的氧化环化与脱氢反应的催化机制以及选择性进行了探究，证实了类BBE酶中的一个天冬氨酸残基可以作为催化碱通过去质子化促进二烯产物的产生；而缺失该残基则会导致氧化环化发生。

　　在前期研究中，雷晓光课题组发现了桑科植物中类BBE酶具有催化氧化脱氢、氧化环化以及分子间Diels-Alder反应的活性，并且解析了白桑中分子间Diels-Alder反应酶的自然演化历程（Nat. Chem. 2020, 12, 620; Nat. Catal. 2021, 4, 1059; Nat. Commun. 2024, 15, 2492; Acc. Chem. Res. 2024, 57, 2166）。在这些类BBE酶中存在一些功能杂泛性酶，它们能够同时催化氧化脱氢以及氧化环化反应的，比如MaDS1和MaDS6。这种功能杂泛性在类BBE酶中并不常见，氧化脱氢酶与氧化环化酶精确调控不同氧化路径的分子机制仍不清楚。

　　在该研究中，作者首先分别解析了MaDS1-FAD（图1A&B）以及MaDS1-FAD-氧化脱氢产物复合物的晶体结构，并在复合物晶体结构的基础上用底物moracinC进行分子对接（图1C），并根据分子对接结果进行了丙氨酸扫描突变试验。结果表明Y116能够与底物的酚羟基形成氢键相互作用，对于底物识别非常关键；而D175/R314/D410能够形成氢键相互作用网络辅助氧化脱氢反应的发生，其中D175对于氧化脱氢反应活性极为重要（图1D&E）。

　　图1. MaDS1晶体结构及基于结构的突变研究

　　随后，通过同源序列比对，作者发现Y116在所有氧化酶中都是保守的，而D175和R314则在氧化脱氢酶中保守，在单功能氧化环化酶中对应D175的氨基酸则为较为疏水的L或者V，对应R314的氨基酸则为S，这也能够表明D175和R314可能存在着共进化的关系（图2A）。在晶体结构中，D175距离氧化脱氢中所需要被去质子化的甲基距离较近，因此作者推断该氨基酸可能作为催化碱对底物进行去质子化，因而将该天冬氨酸突变为天冬酰胺或者谷氨酸，结果表明D175E突变体仍具有氧化脱氢的活性，说明D175的羧酸基团对于氧化脱氢活性至关重要（图2B）。另外，在其他单功能氧化脱氢酶上讲该天冬氨酸突变为缬氨酸能够将其转变为单功能的氧化环化酶，而在单功能氧化环化酶的该位置引入天冬氨酸基团也可以使其获得氧化脱氢的活性。该结果证实了这一位点取代在氧化环化酶（OCs）向脱芳构化酶（DSs）进化过程中的关键作用。综合上述发现，他们证实了D175位羧基对促进白桑（M. alba）BBE类酶催化氧化脱氢反应的重要功能（图2C）。

　　图2. D175是对于氧化环化反应至关重要的氨基酸残基

　　最后，作者通过密度泛函理论（DFT）计算以深入探究氧化反应的分子机制：该反应首先发生底物向FAD的负氢转移，形成烯丙基碳正离子中间体，随后在有无D175的参与的情况下有两条反应路径。没有D175参与的情况下，中间体去质子化形成醌式中间体，该中间体随后可以发生一步在空腔外自发的6π电环化反应得到氧化环化的产物（能垒22.0 kcal/mol），分子动力学（MD）模拟也表明该中间体无法在酶口袋内稳定存在，印证了这一结论；而另一条路径则是通过D175对于碳正离子中间体去质子化，随后形成了氧化脱氢产物（能垒22.3 kcal/mol）。该计算结果解释了MaDS1对氧化环化的选择性高于氧化脱氢（图3）。

　　图3. MaDS1催化氧化环化及氧化脱氢反应的DFT计算

　　总结而言，作者通过X射线晶体学、定点突变、序列分析、分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT）计算，阐明了BBE类酶催化氧化脱氢和环化反应的分子机制。FAD辅基从底物中攫取氢负离子形成碳正离子中间体。在氧化脱氢酶中，保守的天冬氨酸残基作为催化碱使中间体甲基去质子化，从而引导反应生成二烯产物；而在氧化环化酶中，由于缺乏此类碱性催化残基，中间体通过自发6π电子电环化反应生成苯并吡喃产物。这些发现不仅揭示了BBE类二烯合酶的进化机制，还为桑属植物中结构多样的天然产物的功能作用提供了更深层次的机制解释。对BBE类酶催化氧化脱氢和环化过程的机制理解，将显著提升我们理性改造这些氧化酶的能力，为定向合成结构多样的类天然产物化合物奠定基础。

　　北京大学雷晓光课题组博士研究生郭念昕和南京理工大学的博士研究生顾军为论文的共同第一作者，北京大学雷晓光教授，加州大学洛杉矶分校 K. N. Houk 教授和原北京大学雷晓光团队副研究员，现武汉大学高磊教授为论文的共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会、The National Science Foundation of the US、北京分子科学国家研究中心、北大-清华生命科学联合中心、新基石基金会等项目或单位的资助。

　　原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2504346122

排版：高杨
审核：李玲，刘志博